Descripción

SERVICIO DE ANALISIS DE PROTEÍNAS
INSTITUTO DE BIOQUÍMICA VEGETAL Y FOTOSÍNTESIS - 2015

DESCRIPCIÓN Y NORMAS DE FUNCIONAMIENTO


El objetivo principal del Servicio de Análisis de Proteínas del IBVF es la identificación de proteínas de interés biológico, así como la determinación de masas moleculares de péptidos y proteínas en solución, mediante espectrometría de masas.
Para ello, cuenta con diferentes equipos para la preparación y el análisis de las muestras:
-Sistema para el recorte automatizado de proteínas en gel de una o dos dimensiones, Modelo EXQuest Biorad.
-Espectrómetro de masas con analizador de tiempo de vuelo e ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI-TOF) con capacidad para fragmentar péptidos, Modelo 5800, ABsciex.
-Espectrómetro de masas híbrido, Triple cuadrupolo-TOF acoplado a nanoLC, Modelo 5600, ABsciex que permite análisis LC-MS/MS.
El Servicio de Análisis de Proteínas nace para satisfacer las necesidades de los grupos de investigación del IBVF aunque está a disposición de cualquier institución pública o privada que lo solicite. Los análisis ofertados por el servicio son los iguientes:
•Determinación de masas moleculares de proteínas y péptidos en solución, mediante espectrometría de masas (MALDI-TOF/TOF).
Consideraciones sobre la muestra: En función de la masa molecular (del péptido o proteína en cuestión), la concentración necesaria para la medida variará desde algunos femtomoles (en el caso de péptidos), a cientos de picomoles por microlitro (en el caso de proteínas de mayor tamaño), siempre que la disolución esté libre de sales, detergentes y otros contaminantes que pueden impedir o dificultar la co-cristalización de la muestra con la matriz o suprimir la señal en el MALDI-TOF.
•Identificación de proteínas mediante huella peptídica (Peptide Mass Fingerprinting). Este análisis incluye:
-Digestión enzimática, generalmente con tripsina, de las manchas proteicas a partir de geles de 2-DE o SDS-PAGE (1-D) o proteínas en solución, de forma manual. Las manchas proteicas de geles deben contener la menor cantidad posible de acrilamida. En cuanto al grosor de los geles, es aconsejable que sea entre 0.75 y 1 mm, y la concentración de acrilamida próxima a 12%. Se debe trabajar con la mayor limpieza posible para evitar la contaminación de las manchas proteicas con queratinas.
- Análisis del digerido tríptico mediante espectrometría de masas MALDI-TOF/TOF. Para cada proteína, la digestión con tripsina produce un espectro característico y único con diferentes fragmentos trípticos que es lo que se conoce como huella peptídica.
- Comparación de la huella peptídica experimental con la teórica obtenida “in silico” de todas las proteínas presentes en las bases de datos, y posterior identificación de la proteína. Para que se pueda producir la identificación positiva de una proteína es necesario que su secuencia esté incluida en las bases públicas de datos. En el caso de que la identificación con huella peptídica no sea positiva, se podrán incluir datos de fragmentación de los péptidos trípticos más intensos, lo que ayudaría a la identificación ya que incluiría información de secuencia.
• Identificación masiva de proteínas en solución mediante espectrometría de masas acoplada a cromatografía liquida de alta eficacia (LC-MS/MS). De forma similar al análisis anterior, extractos proteicos en solución se digieren con tripsina. Los péptidos trípticos resultantes se someten a nanocromatografía líquida de alta eficacia (nanoHPLC) donde se separan en columna C18 de fase reversa, se ionizan por electrospray y se fragmentan en el híbrido triple cuadrupolo-TOF, generándose una librería de miles de espectros. Con estos espectros ms/ms, el software Protein Pilot (Sciex) identifica masivamente las proteínas.
Este equipamiento también permite cuantificación relativa libre de marca mediante la tecnología SWATH.
Se entregará un informe Científico-Técnico con cada resultado. En ocasiones, debido al tamaño de los archivos, los “raw data” se suministrarán de forma telemática.
Para la realización de cualquier prestación, será requisito la aceptación por parte del usuario de la oferta de prestación correspondiente que previamente le habrá suministrado el responsable del servicio.
Las muestras para analizar serán entregadas personalmente en el Servicio o enviadas por correo o mensajería por los usuarios. Previamente, el usuario debe contactar con los técnicos del Servicio para determinar las condiciones del envío de muestras.
Esta información se encuentra en la página web del Instituto, (http://www.ibvf.csic.es/descripcion-analisis-proteinas). Para cualquier duda o solicitud contactar con el técnico responsable del servicio (rocio.rodriguez@ibvf.csic.es)